Analytische Systeme

Trenntechniken

• Hochleistungsflüssigchromatographie Systeme – (High Performance Liquid Chromatography Systems; HPLC)
• Gaschromatographie – Gas Chromatography (GC)
• Hochleistungsdünnschichtchromatographie – High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)
• Elektrophorese – Electrophoresis

Detektorsysteme

• Massenspektrometrie– Mass Spectrometry (MS)
• Photodiodenzeilendetektor – Dioden Array Detektor (DAD)
• Fluoreszenzdetektor – Fluorescence Detector (FLD)
• Flammenionisationsdetektor – Flame Ionisation Detector (FID)

Analysensysteme

• Karl-Fischer-Titration – Bestimmung des Wassergehaltes
• Rancimat – Bestimmung der Qualität von Fetten und Ölen

Trenntechniken

Hochleistungsflüssigchromatographie – High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

In erster Linie handelt es sich bei der HPLC um eine Trennmethode für Stoffgemische. Die Probenlösungen
werden mittels einer mobilen Phase (Eluent) über eine stationäre Phase – die Trennsäule – transportiert. Die Substanzen in der Probe gehen dann reversible Wechselwirkungen mit den Säulenmaterial ein. Je stärker die Wechselwirkungen sind, desto langsamer „laufen“ die Substanzen über die Trennsäule. Somit ergeben sich für die Analyten unterschiedliche
Durchlaufzeiten (Retentionszeiten – Rt) und man erhält eine Trennung der Substanzen.

Grundsätzlich lässt sich die HPLC nach den Trennmechanismen wie folgt unterteilen:

• Größenausschlusschromatographie
• Adsorptionschromatographie
• Verteilungschromatographie
• Ionenchromatographie
• Affinitätschromatographie

Bei der am häufigsten angewandten Adsorptionschromatographie wird weiterhin in die Normal-Phase-Chromatographie (Normal-Phase-Chromatography – NP) und dieUmkehr-Phasen-Chromatographie (Reversed-Phase-Chromatography – RP) unterschieden. Der grundlegende Aufbau der HPLC-Anlagen und der Trennablauf sind in jeden Fall der Selbe.

Durch den Einsatz von externen Standardsubstanzen ist neben der Identifizierung auch die Quantifizierung (Gehaltsbestimmung) von einzelnen Substanzen möglich.

Unsere HPLC-Anlagen sind mit verschiedensten Detektoren wie z.B. Photodiodenarraydetektoren und Massenspektrometern ausgestattet. Neben den üblichen RP-HPLC-Anlagen befindet sich auch eine Ionenchromatographieanlage in unserem Institut. Diese wird hauptsächlich für die Identifizierung und Quantifizierung von Zuckern eingesetzt.

Gaschromatographie – Gas Chromatography (GC)

Die Gaschromatographie ist ein weiteres Trennverfahren für verschiedenste Substanzen.
Auch hier wird – wie in der HPLC – mit einer stationären Phase und einer mobilen Phase gearbeitet. Allerdings handelt es sich bei der mobile Phase in der Gaschromatographie um eine Trägergas (meist Helium). Dieses nimmt die gasförmig vorliegenden Analyten auf und transportiert sie durch die gaschromatographische Trennsäule, die mit der stationären Phase ausgestattet ist. Wichtig ist dabei, dass die Analyten ausreichend flüchtig sind. Ist dies nicht der Fall, muss gegebenenfalls ein Derivatisierungsschritt erfolgen. Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der stationären Phase bewirken die Auftrennung von Substanzgemischen, wobei die Elutionsreihenfolge abhängig von der Flüchtigkeit der Probenkomponenten ist, sodass bei homologen Reihen die leichter flüchtigen Verbindungen zuerst eluiert werden. An die Auftrennung können sich dann verschiedenste Detektoren anschließen.

Das IBAS verfügt über mehrere gaschromatographische Systeme, die über FID-Detektoren und z.T. auch durch GC-MS-Kopplung die Identifikation sowie quantitative Analyse von Fettsäure- haltigen Probengemischen oder insbesondere ätherischen Ölen ermöglichen. Hinsichtlich der Injektion kann zwischen Split- oder PTV-Injektoren gewählt werden. Als gaschromatographische Trennsäulen kommen je nach Probenanforderung geeignete Kapillarsäulen mit oder ohne Vorsäule zum Einsatz. Über die Flüssiginjektion hinaus sind zudem verschiedenste Möglichkeiten der Probenvorbereitung gerätetechnisch anwendbar. Hierzu gehören u.a. die Solid-phase Dynamic Extraction (SPDE – dynamische Festphasenextraktion) sowie die Solid-phase Microextraction (SPME – Festphasenmikroextraktion). Beispielsweise für die SPDE-Anwendung kann der automatische PAL-Probengeber auf eine mit einer belegten Kanüle ausgestattete, gasdichte Spritze umgerüstet werden und integriert damit, wie auch die SPME, Probenahme, Extraktion, Konzentration und Probenaufgabe in einem einzigen Verfahren. Bei allen Verfahren (SPME, SPDE, SBSE/HSSE) ist es generell möglich, Headspace-Analysen auch von festen Proben durchzuführen.

Eine unserer Gaschromatographieanlagen ist mit einem so genannten Olfaktometer ausgestattet. Dieses ermöglicht die sensorische – in diesem Fall geruchliche – Beurteilung und Beschreibung der getrennten Substanzen. Um diese Arbeit durchführen zu können, muss der jeweilige Mitarbeiter zuvor eine spezielle sensorische Schulung durchlaufen. Durch diese Methodiken können olfaktometrische Profile von Proben erstellt werden.

Hochleistungsdünnschichtchromatographie – High Performance Thin Layer Chromatography (TLC)

Bei der HPTLC werden die Proben als Bande auf eine mit Trennmaterial beschichtet Glas- oder Aluminiumplatte aufgesprüht. Die Auftragung erfolgt mittels spezieller Auftragesysteme voll automatisch. Während des Aufsprühens wird das Lösungsmittel durch einen Stickstoffstrom abgedampft und die Proben so getrocknet.
Zur Entwicklung wird die HPTLC-Platte in eine mit Lösungsmittel gefüllte Entwicklungskammer gestellt.
Das Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch steigt durch Kapillarkräfte im Trennmaterial nach oben.
Auf dem Laufweg löst es die Probensubstanzen und transportiert sie von der Auftragsposition weg.
Je stärker die Wechselwirkung mit dem Lösungsmittel ist, desto weiter wird der Analyt von diesem transportiert.

Im Gegensatz dazu ist die Laufstrecke des Analyten geringer, wenn die Wechselwirkung mit dem Trennmaterial stärkerist.

Neben dieser „normalen“ Entwicklung befindet sich auch eine automatisiert Mehrfachentwicklungskammer in unserem Institiut. Mit dieser können die Entwicklungen in mehreren Schritten vollautomatisch mit unterschiedlichen Lösungsmittel entwickelt werden. Zwischen den einzelnen Schritten erfolgt eine vollständige Trocknung der HPTLC-Platte. Nach der erfolgreichen Entwicklung können die Analytbanden unter UV-Licht betrachtet werden. Auch die nachträgliche Anfärbung zur Betrachtung unter Weißlicht ist möglich. Spezielle Densitometer und Scanner ermöglichen die Erfassung der Farbintensitäten. So können auch Kalibrierungen erstellt und eine Quantifizierung der Analyten durchgeführt werden.

Als zusätzliche Möglichkeit der Detektion können Spots direkt über ein TLC-MS-Inferface in ein Massenspektrometer überführt werden.Probenaufgabe: Softwaregesteuerte, Automatisierte Probenauftragegeräte

• Entwicklung: Ausstattung zur Horizontalen/ Vertikalen Entwicklung; AMD, AOC
• Auswertung: Softwaregesteuerter Scanner für UV/Vis Densitometrie
• Dokumentation: Softwaregesteuerte Kamera zur Dokumentation der DC-
• entwickelten DC-Platten

Elektrophorese – Electrophoresis

Die Elektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, bei der Gemische (Proteine) von positiv oder negativ geladenen Molekülen mit Hilfe eines elektrischen Gleichstromfeldes getrennt werden. Je nach Vorzeichen der Ladung wandern die Teilchen entweder zur Kathode oder zur Anode. Verschiedene Teilchen wandern im elektrischen Feld verschieden schnell.

Die Beweglichkeit ist abhängig von:

• Nettoladung
• Molekülgröße
• Molekülgestalt
• Temperatur
• pH-Wert, Ionenstärke des Laufpuffers
• Feldstärke
• Trägermaterial.

Im IBAS sind für analytische Aufgabenstellungen folgende Gerätesysteme vorhanden:

• IEF/ Isoelektrische Fokussierung
  Die Proteinauftrennung erfolgt nach dem pH-Wert. Sie wird angewendet für Untersuchung von Kartoffel- und Getreideproteinen
• SDS-PAGE/ Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese
  Die Proteinauftrennung erfolgt nach der Molekülgröße. Sie dient der Untersuchung von Gliadinen und Gluteninen in Getreide- sowie von Fleischproteinen
• Serumeiweiß- Elektrophorese
  Die Proteinauftrennung erfolgt nach der Ladung. Sie wird angewandt zur Untersuchung der Eiweißstoffe im Blutserum (Lehrveranstaltung)
• 2D Elektrophorese/ 2 dimensionale Elektrophorese
  Die 2D- Gelelektrophorese ist eine Methode in der Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik. Sie kombiniert die IEF mit der SDS-PAGE zur Trennung komplexer Proteingemische. Die 2D-Technik wird zur Charakterisierung pflanzlicher und tierischer Zellzustände angewendet.

Detektorsysteme

Massenspektrometrie – Mass Spectrometry (MS)

Bei der Massenspektrometrie handelt es sich um eine Detektionsmethode zur Bestimmung von freien Ionen im Hochvakuum auf Basis ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses. Das Massenspektrometer (MS) setzt sich dabei grundsätzlich aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator und einem Detektor zusammen. Die Ionenquelle erzeugt positiv oder negativ geladene Ionen aus ungeladenen Molekülen, beispielsweise durch Anlegen einer Spannung. Es gibt verschiedene Ionenquellen:

• für die GC-MS – Elektronenstoßionisation (EI) und die chemische Ionisation (CI)
• für die HPLC-MS – u.a. Elektrosprayionisation (ESI), die Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
• Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI)

Eine zusätzliche Ionenfalle (Linear Ion Trap (LIT)) ermöglicht weitere MS-Analysemethoden. Zur Detektion kommen beispielsweise Photomultiplier oder Sekundärelektronenvervielfältiger zum Einsatz.

In unserem Labor stehen zwei GC-MS und drei HPLC-MS/MS-Systeme zur Verfügung.

Die Massenanalysatoren trennen die entstandenen Ionen entweder in einem eletkrischen Feld (Quadrupol) oder über ihre Flugzeit (Time-Of-Flight – TOF) nach dem Masse-Landungsverhätnis.

Bei unseren HPLC-Systemen handelt es sich generell um Triple-Quadrupol-Systeme. Dadurch sind MS-Modi wie der Product-Ion-Scan zur gezielten Erzeugung von Fragmentionen (z.B.: zur Strukturaufklärung) oder der Multiple-Reaction-Monitoring zur selektiven und sensitiven Quantifizierung von Analyten möglich.

Photodiodenzeilendetektor – Dioden Array Detektor (DAD)

Diese Detektoren bestehen aus einem Detektorchip, bei den die Photodioden nebeneinander in einer Zeile angeordnet sind. Je nach zu erfassender Wellenlänge bestehen die Dioden aus unterschiedlichen Materialien.
Weiterhin enthält der Detektor eine Lampe für den UV und eine für den visuellen Lichtbereich.
Wird eine Substanz durch den Detektor geschickt, absorbiert diese einen Teil des von den Lampen abgestrahlten Lichtes. Die Photodioden nehmen die Abschwächung (Extinktion) des Lichtes auf. Aus der Extinktion wird dann die Absorption ermittelt und als Substanzpeak im Ergebnischromatogramm ausgegeben. Wichtig das ist, dass sich die Extinktion bzw. die Absorption direkt proportional zur Substanzkonzentration verhält. D.h. je größer die Konzentration ist, desto höher ist auch die Absorption bzw. Extinktion und desto größer ist auch der Ergebnispeak.

Fluoreszenzdetektor – Fluorescence Detector (FLD)

Der grundlegende Aufbau dieses Detektors ähnelt stark dem des DAD. Es gibt aber einige entscheidende Unterschiede in der Funktionweise. Wie auch beim DAD wird hier von einer UV-Lampe Licht ausgestrahlt. In diesem Fall spricht man von Anregungsstrahlung. Durchläuft jetzt eine Substanz den Detektor wird sie aufgrund der Anregungstrahlung dazu veranlasst selbst eine Strahlung zu emitieren. Diese Lichtemission nennt man Fluoreszenz, wenn die Emission nur für einen kurzen Zeitraum auftritt. Das Fluoreszenslicht wird im 90° Winkel zum Anregungslicht von Photodioden erfasst um keine Anteile des Anregungslichtes mit zu erfassen. Auch hier ist die Intensität direkt proportional zu Substanzkonzentration.

Flammenionisationsdetektor – Flame Ionisation Detector (FID)

Der FID ist einer der häufigsten Detektoren in der Gaschromatographie.
Die zu analysierende Substanz wird mittels eines Trägergases in eine Wasserstoffflamme
geleitet und hier thermisch ionisiert. So werden Elektronen freigesetzt, welche
als Stromfluss gemessen werden können.
Dieser wird dann als Peak im Chromatogramm widergegeben.
Vorteile des FID sind seine Robustheit, die hohe Stabilität des Ausgangssignals und
ein gewisser Reinigungseffekt durch die hohen Verbrennungstemperaturen.

Analysensysteme

Karl-Fischer-Titration – Bestimmung des Wassergehaltes

Die Karl-Fischer-Titration ist das Mittel der Wahl zu Bestimmung des Wassergehaltes von Probenmaterialen. Im Gegensatz zur Differenzwägung durch Trocknung wird neben freiem Wasser auch gebundenes Wasser ermittelt. Die Trocknung hat weiterhin den Nachteil, dass flüchtige Substanzen der Proben, die nicht Wasser sind, das Ergebnis verfälschen können.

Grundlage für dieses Verfahren ist die Reaktion von Schwefeldioxid und Jod, welche ausschließlich in Anwesenheit von Wasser abläuft. Wird ein Alkohol hinzugegeben, reagiert dieser mit dem Schwefeldioxid zu einem saueren Ester. Dieser wird durch eine Base (Bsp.: Pyridin, Imidazol) neutralisiert. Bei der Titration kommt eine Lösung aus Methanol und Jod zum Einsatz. Dadurch wird das Methylsulfit-Anion durch das Jod und in Anwesenheit von Wasser zum Methylsulfat-Anion oxidiert. Dabei wird das farbige Jod zu farblosem Jodid reduziert. Ist das Wasser in der Probe verbraucht, wird das zutitrierte Jod nicht mehr zu Jodid umgesetzt. Dieser Punkt wird amperometrisch ermittelt und die zusammen dosierte Jodmenge dient als Maße für das in der Proben vorhandene Wasser.

Voraussetzung für dieses Verfahren ist die Löslichkeit der Probe in der methanolischen Lösung. Sollte die Probe nicht löslich sind, wie zum Beispiel bei Pulvern und festen Proben, kann die Probe in einem speziellen Ofen ausgeheizt werden.

Rancimat – Bestimmung der Qualität von Fetten und Ölen

Der Rancimat wird für die Bestimmung der Qualität von natürlichen Fetten und Ölen sowie zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antioxidantien eingesetzt. Zusätzlich können fetthaltigeProben wie zum Beispiel Lebensmittel oder Kosmetika auf ihre Stabilität hin untersucht werden.

Im Rancimat wird die Probe mit Luftsauerstoff durchmischt und gleichzeitig erhitzt. Die entstehenden Oxidationsprodukte werden mittels Luftstrom in mit bidestiliertem Wasser gefüllte Messzellen geleitet und erhöhen dort die Leitfähigkeit der Lösung. Der Punkt, an dem die Leitfähigkeit schlagartig stark ansteigt, stellt die sogenannte Induktionszeit dar. Dieser Zeitpunkt ist abhängig von der Qualität und Zusammensetzung des Fettes bzw. der Wirksamkeit von Antioxidatien. Eine kurze Induktionszeit deutet auf eine schlechte Fettqualität bzw. auf eine geringe Wirksamkeit von Antioxidatien hin. Sie ist auch ein Hinweis auf die Zusammensetzung des Fettes. Fette mit einem langkettigen, gesättigtem Fettsäuremuster weisen höhere Induktionszeiten auf als kurzkettige und ungesättigte Fette.

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